Alaabta
Qalabka lagu ogaanayo Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR ee 2019-nCoV
Isticmaalka la filayo
Qalabkan waxa loo isticmaalaa in lagu ogaado tayada cudurka coronavirus-ka cusub (2019-nCoV) iyadoo la isticmaalayo xuubka dhuunta, sanka sanka, dheecaanka dheecaanka bronchoalveolar, xaakada. caddaynta ogaanshaha iyo daawaynta kiliinikada. Falanqaynta guud ee xaaladda ayaa lagula talinayaa iyadoo lagu daray calaamadaha bukaan-socodka iyo shaybaarrada kale ee shaybaarka.
Mabda'a kormeerka
Qalabku wuxuu ku salaysan yahay hal-tallaabo tignoolajiyada RT- PCR.Dhab ahaantii, 2019-ka cusub ee coronavirus (2019-nCoV) ORF1ab iyo hiddo-wadaha N ayaa loo doortay sidii gobollada la beegsanayo.Aasaasayaal gaar ah iyo shaybaarro florescent ah (Baadhitaannada hidda-wadaha N waxaa lagu calaamadeeyay FAM iyo ORF1ab baaritaannada waxaa lagu calaamadeeyay HEX) waxaa loogu talagalay in lagu ogaado 2019 nooca cusub ee coronavirus RNA ee muunadaha.Qalabka waxa kale oo ka mid ah nidaamka ogaanshaha kontoroolka gudaha ee endogenous (internal control probe genes oo lagu calaamadeeyay CY5) si loola socdo habka muunada ururinta, RNA iyo PCR-weyn, si loo yareeyo natiijooyinka xun ee beenta ah.
Qaybaha ugu muhiimsan
| Qaybaha | Mugga(48T/Qalabka) |
| Xalka falcelinta RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864µl |
| Xakamaynta xun | 1500µl |
| nCOV Contro Togan (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Dib-u-hawlgalayaasha gaarka ah: Soo saarista RNA ama nadiifiyeyaasha nadiifinta.Xakamaynta taban/koontoroolka togan: Kantaroolka togan waa RNA oo ka kooban jajabkii la beegsanayay, halka kantaroolka taban uu yahay biyo ka xor ah aashitada nucleic.Inta lagu jiro isticmaalka, waa inay ka qaybqaataan soo saarista waana in loo tixgeliyaa inay yihiin kuwo faafa.Waa in loo maareeyaa oo la tuuraa si waafaqsan xeerarka khuseeya.
Hidde-sidaha tixraaca gudaha waa hidda-wadaha RnaseP ee aadanaha.
Xaaladaha kaydinta iyo taariikhda dhicitaanka
-20±5℃, iska ilaali qaboojinta soo noqnoqda iyo dhalaalidda in ka badan 5 jeer, oo shaqaynaysa 6 bilood.
Qalabka lagu dabaqi karo
Iyada oo leh FAM / HEX / CY5 iyo qalab PCR kale oo badan oo fluorescent ah.
Shuruudaha tijaabada
1. Noocyada muunada ee lagu dabaqi karo: dhuunta dhuunta, suufka nasopharyngeal, dareeraha dheecaanka bronchoalveolar, xaakada.
2.Specimen ururinta (farsamada septic)
Xuubka qanjidhada: Ku masax qumanka iyo gidaarka pharyngeal ee dambe laba suuf isku mar, ka dibna madaxa suufka dhex geli tuubo tijaabo ah oo ay ku jirto xal muunad
Xaakada: Ka dib marka uu bukaanku yeesho qufac qoto dheer, ku soo ururi xaakada qufacaysa tuubada tijaabada furka ee ay ku jirto xal muunad;Dheecaan fayadhowrka bronchoalveolar: Muunad ay sameeyeen xirfadlayaasha caafimaadka.3.Kaydinta iyo qaadista shaybaarada
Tusaalooyinka go'doominta fayraska iyo baaritaanka RNA waa in la tijaabiyaa sida ugu dhakhsaha badan.Muunada lagu ogaan karo 24 saacadood gudahood waxa lagu kaydin karaa 4 ℃;kuwa aan lagu ogaan karin 24 gudahood
saacadaha waa in lagu kaydiyaa at -70 ℃ ama ka hooseeya (haddii aysan jirin xaalad kaydinta ee -70 ℃, waa in ay ahaataa
si ku meel gaar ah loogu kaydiyaa -20 ℃ qaboojiyaha).Tijaabooyinku waa inay iska ilaaliyaan qaboojinta soo noqnoqda iyo dhalaalidda inta lagu jiro gaadiidka.Muunada waa in loo diraa shaybaadhka sida ugu dhakhsaha badan ee suurtogalka ah ka dib ururinta.Haddii shaybaarrada loo baahan yahay in lagu qaado masaafo dheer, baraf qallalan ayaa lagu talinayaa in lagu kaydiyo.
Hababka Imtixaanka
1 Sambal farsamaynta iyo soo saarista RNA (meesha muunad samaynta)
Waxaa lagu talinayaa in la qaato 200μl oo muunad dareere ah si loo soo saaro RNA.Tallaabooyinka soo saarista la xidhiidha, tixraac tilmaamaha xirmooyinka soo saarista RNA ee ganacsiga.Mid xun iyo mid xunba
kontaroolada xirmadan ayaa ku lug lahaa soo saarista.
2 PCR reagent diyaarinta (aagga diyaarinta reagent)
2.1 Ka saar dhammaan qaybaha xirmada oo dhalaal oo ku qas heerkulka qolka.Centrifuge at 8,000 rpm dhowr ilbiriqsi kahor isticmaalka;xisaabi inta loo baahan yahay reagents, iyo habka falcelinta waxaa loo diyaariyey sida ku cad shaxda soo socota:
| Qaybaha | N adeegaya (Nidaamka 25µl) |
| nCOV asaasiga ah ee TaqMan probemixture | 18µl × N |
| Xalka falcelinta RT-PCR | 2µl × N |
| *N = tirada muunadaha la tijaabiyay + 1 (kontarool xun) + 1 (nCOVxakamaynta togan) | |
2.2 Ka dib markaad si fiican u walaaqdo qaybaha, centrifuge muddo gaaban si aad u oggolaato dhammaan dareeraha derbiga tuubada inay ku dhacaan qaybta hoose ee tuubada, ka dibna ku dheji habka 20 µl ee habka xoojinta tuubada PCR.
3 Muunad (goobta diyaarinta muunada)
Ku dar 5μl kontaroolada taban iyo kuwa togan ka dib soo saarista.RNA ee muunada la tijaabinayo waxaa lagu daraa tuubada falcelinta PCR.
Ku dabool tuubada si adag oo sentrifuge at 8,000 rpm dhowr ilbiriqsi ka hor inta aadan u gudbin aagga ogaanshaha cod-weyneysiinta.
4 PCR amplification (aagga ogaanshaha la kordhiyay)
4.1 Geli tuubada falcelinta gudaha unugga muunada ee qalabka, oo u deji cabbirada sida soo socota:
| Marxalad | Wareegto tirada | Heerkulka(°C) | Waqtiga | ururingoobta |
| Gadaalqoraal ahaan | 1 | 42 | 10min | - |
| Pre-denaturationn | 1 | 95 | 1 daq | - |
| Wareegto | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | xog ururin |
Xulashada kanaalka ogaanshaha qalabka: Dooro FAM, HEX, CY5 kanaalka calaamada iftiinka.Wixii tixraaca fluorescent WAX, fadlan ha dooran ROX.
5 Natiijooyinka falanqaynta (Fadlan tixraac tilmaamaha tijaabada ah ee qalab kasta si aad u dejiso)
Falcelinta ka dib, badbaadi natiijooyinka.Falanqaynta ka dib, hagaajinta qiimaha bilowga, qiimaha dhammaadka, iyo qiimaha bilowga ee gundhigga sida waafaqsan sawirka (isticmaalku wuxuu hagaajin karaa iyadoo loo eegayo xaaladda dhabta ah, qiimaha bilawga waxaa loo dejin karaa 3 ~ 15, qiimaha dhamaadka waxaa lagu dhejin karaa 5 ~ 20, hagaajinta) ee garaafka logarithmic Marka la eego marinka daaqada, xariiqda marinka ayaa ku jirta marxaladda logarithmic, iyo qalooca kontoroolka taban waa xariiq toosan ama ka hooseeya xariiqda marinka).
6 Xakamaynta tirada （Kontoroolka habraaca ayaa lagu soo daray tijaabada
Kontoroolka togan ee COV: qalooca kor u qaadida cad ee FAM iyo kanaalada ogaanshaha HEX, Ct qiimaha≤32, laakiin ma jiro qalooca kor u qaadida kanaalka CY5;
Shuruudaha kor ku xusan waa in si isku mar ah loo buuxiyo isla tijaabada;haddii kale, tijaabadu waa mid aan shaqaynayn oo u baahan in lagu celiyo.
7 Go'aaminta natiijooyinka.
7.1 Haddii aysan jirin qalooca kor u qaadista ama qiimaha Ct> 40 ee FAM iyo kanaalka HEX ee muunada tijaabada, oo uu jiro qalooca kor u qaadista kanaalka CY5, waxaa lagu xukumi karaa inuusan jirin 2019 coronavirus cusub (2019-nCoV) RNA ee muunada;
.2 Haddii muunadda tijaabada ahi ay leedahay qaloocyo kor u qaadis cad oo FAM ah iyo kanaalka HEX, oo qiimaha Ct uu yahay ≤40, waxaa lagu xukumi karaa in muunadda ay togan u tahay 2019 cusub coronavirus (2019-nCoV).
7.3 Haddii muunada tijaabada ahi ay leedahay qalooca cod-weyneyn cad oo keliya hal kanaal oo FAM ama HEX ah, oo qiimaha Ct uu yahay ≤40, oo aysan jirin qalooca dhawaaqa kan kale, natiijooyinka waxay u baahan yihiin in dib loo tijaabiyo.Haddii natiijooyinka imtixaanku ay yihiin kuwo joogto ah, muunadda waxaa lagu qiimeyn karaa inay u wanaagsan tahay kan cusub
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Haddii natiijadii ku celiska ahayd ay tahay diidmo, waxaa lagu xukumi karaa in muunadda ay diidmo u tahay 2019-ka cusub ee coronavirus (2019-nCoV).
Qiimaha xukunka togan
Habka qalooca ROC waxaa loo isticmaalaa in lagu go'aamiyo tixraaca CT qiimaha xirmada iyo qiimaha tixraaca kontoroolka gudaha waa 40.
Fasiraadda natiijooyinka imtixaanka
1.Tijaabo kasta waa in lagu tijaabiyaa xakamaynta taban iyo kuwa togan.Natiijooyinka tijaabada waxaa la go'aamin karaa kaliya marka kontaroolada ay buuxiyaan shuruudaha xakamaynta tayada
2.Marka FAM iyo kanaalada ogaanshaha HEX ay yihiin kuwo wanaagsan, natiijada ka soo baxda kanaalka CY5 (kanaalka kontoroolka gudaha) ayaa laga yaabaa inay diidmo sababtoo ah tartanka nidaamka.
3. Marka natiijada kontoroolka gudaha ay tahay mid taban, haddii tuubada baaritaanka FAM iyo kanaalada HEX ay sidoo kale taban yihiin, , waxay la macno tahay in nidaamka uu naafo yahay ama qalliinku uu khaldan yahay, t imtixaanku waa sax.Sidaa darteed, shaybaarada waxay u baahan yihiin in dib loo tijaabiyo.
